Circulation│c-kit 细胞对成体心肌细胞贡献的再评价

2019-07-31 17:13 by 鼎博彩票生物


7月8日,国际学术期刊Circulation在线发表了中国科学院生物化学与细胞生物学研究所周斌研究组与中国医学科学院阜外医院心血管疾病国家重点实验室聂宇课题组的最新科研成果“Reassessment of c-Kit+?Cells for Cardiomyocyte Contribution in Adult Heart”。


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該研究利用雙同源重組系統(Cre-loxP和Dre-rox)構建了兩個可以有效標記Kit+細胞且不影響內源Kit基因表達的小鼠模型,並利用這些模型對Kit+的心髒幹細胞(CSCs)是否參與成體心肌細胞的生成進行了探討。研究結果顯示,無論心髒處于穩態或損傷狀態下,都不會參與新生的心肌細胞的生成。?


鼎博彩票生物爲該研究構建了Kit-2A-Cre和Kit-IRES-Cre;Tnnt2-DreER這兩個小鼠模型。


限于之前的小鼠模型無法有效追蹤CSCs的命運,Kit+?CSCs是否具有肌源潛能一直存在爭議[1-3]。去年發表在Nature上的一篇文章對已有的Kit-Cre模型進行了總結,並概括了現有模型的兩大缺陷:1)構建時同源重組酶Cre取代了內源Kit基因的表達,從而引發單倍體不足(haploinsufficiency),即單個Kit等位基因不足以維持其正常功能;2)無法標記Kit表達量低的細胞。

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爲了解決Kit+?CSCs是否具有肌源潛能這一問題,本研究另辟蹊徑,構建了2個全新的Kit-Cre工具鼠品系(Fig.1)。爲了避免對c-Kit基因産生影響,研究人員選擇將Cre插入到Kit的最後一個外顯子後,並通過2A或者IRES元件分隔,從而實現與內源Kit共同表達的目的。


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Fig.1 Schematic figure showing knock-in strategies for Kit-2A-Cre or Kit-IRES-Crealleles by homologous recombination.



Kit2A-Cre/2A-Cre?和 KitIRES-Cre/IRES-Cre纯合子小鼠可以正常存活至成年,检测野生型、纯合子、杂合子小鼠在大小、体重以及心脏大小、体重占比、功能等生理指标均没有差别,并且Kit在纯合小鼠中表达完整(Fig.2)。


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Fig.2 Immunostaining for c-Kit on heart sections show its expression in tissues ofall groups (12–16W).


爲了確定同時標記Kit+細胞和心肌細胞,研究人員首先選擇用心肌細胞特異表達的Tnnt2基因標來記心肌細胞,爲此構建了Tnnt2–DreER小鼠模型。隨後通過Kit–2A-Cre;R26–GFP,Tnnt2–DreER;R26–rox–tdTomato交配,利用Cre-loxP和Dre-rox雙同源重組系統,將Kit+細胞標記爲綠色,將心肌細胞標記爲紅色,這樣就可以從Kit+細胞中區別出非心肌細胞(GFP+tdTomat-)和心肌細胞(GFP+tdTomato+)(Fig.3)。


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Fig.3 Strategy for labeling of?Kit+?cells by dual recombinases-based system.



那麽GFP+tdTomat-的非心肌細胞是否會産生維持GFP+tdTomat-的新生心肌細胞呢?


在小鼠心肌梗死(MI)兩周前進行他莫昔芬誘導,MI四周後進行組織采樣檢測(Fig.4),觀察發現GFP+tdTomato+心肌細胞分布于梗死及梗死邊緣位置,但是在所有的組織切片中都沒有觀察到GFP+tdTomato-心肌細胞,說明心肌梗死後Kit+非心肌細胞不參與新生心肌細胞的生成。


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Fig.4 Immunostaining for green fluorescent protein (GFP), tdTomato, and Troponin I(TNNI3) on myocardial infarction (MI) heart sections.


利用Kit–IRES–Cre模型替換Kit-2A-Cre模型重複該研究(Fig.5),得到的也是相同的結果。


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Fig.5 Immunostaining for GFP, tdTomato, and TNNI3 on MI heart sections.


本研究將兩個新的Kit-Cre模型與雙同源重組酶介導的譜系追蹤策略結合,追蹤kit在成體心髒中的命運,回避了Kit-Cre譜系追蹤問題;不同于以前的Kit-Cre模型,新的Kit-Cre模型不存在Kit單倍體不足的問題,同時標記所有Kit+細胞及其後代。


本研究解決了已有Kit-Cre模型的兩大缺陷,間接證明了內源的Kit+CSCs不是成體心髒心肌更新和修複所必需的。


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References

1.Ellison GM, Vicinanza C, Smith AJ, Aquila I,?et al.Adult c-kit+ cardiac stem cells arenecessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair.?Cell.2013;154:827–842. doi: 10.1016/j.cell.2013.07.039

2.van Berlo JH, Kanisicak O, Maillet M,?et al.c-kit+ cells minimally contribute cardiomyocytes to theheart.?Nature. 2014;509:337–341. doi: 10.1038/nature13309

3.Vicinanza C, Aquila I, Cianflone E, Scalise M, Marino F,??et al.?KitCre knock-in mice fail to fate-map cardiac?stem cells.Nature. 2018;555:E1–E5.doi: 10.1038/nature25771



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